时间分辨荧光在免疫分析中的应用进展（一） 分辨分析荧光寿命长

时间分辨荧光免疫分析技术(time-resolvedfluoroimmunoassay,时间TRFIA)是依赖于稀土元素独特的荧光性质而发展起来的一种免疫检测技术，它集合了放射免疫技术、分辨分析酶联免疫技术以及普通荧光免疫技术的荧光应用优点，具有灵敏度高、免疫特异性强、进展稳定性好，时间且线性范围宽，分辨分析荧光寿命长，荧光应用操作简单和非放射性等特点，免疫在免疫分析领域展现了良好的进展应用前景。围绕时间分辨荧光在免疫分析中的时间最新研究进展，介绍了几种常见的分辨分析用于TRFIA的材料，阐述了TRFIA在免疫诊断、荧光应用食品检测、免疫环境监测等方面的进展应用，并对其发展方向和应用前景进行了展望。

时间分辨荧光免疫分析技术(time-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)是将时间分辨荧光与免疫分析技术相结合，依赖于稀土元素荧光寿命长、Stokes位移大、发射光谱信号峰尖锐等独特的荧光性质而发展起来的一种检测技术，其基本过程是首先利用稀土元素标记抗原或抗体，在一定的体系中与待测物反应形成免疫复合物；然后通过设定适当的延迟时间和门控时间，脉冲激发待测产物，短寿命的背景荧光信号(纳秒级别内)会在延迟时间内衰减消失，再对荧光信号进行采集，得到长荧光寿命的信号信息；最后根据相对荧光强度对待测物进行定量分析。该方法能够消除本底短寿命荧光的干扰，提高了检测信噪比，与传统的荧光检测技术相比，明显提高了荧光检测结果的灵敏度和准确度。

研究从TRFIA的材料和应用两个方面对其进行阐述，列举了几种常见的用于TRFIA的材料及其制备方法的改进，并且对TRFIA在免疫诊断、食品检测、环境监测等领域的应用进行了介绍。

1用于TRFIA的材料

1.1稀土螯合物

稀土离子本身的发光效率较低，引入适当的有机配体与稀土离子配位，利用分子内的能量转移，敏化中心离子发光，可以有效增强稀土离子的荧光性质。选择合适的功能基团和设计适当的配体，使得稀土元素与抗原抗体形成稳定的荧光复合物，可以用于时间分辨荧光免疫分析。常用的稀土螯合剂主要包括多氨基羧酸类、β-二酮类、菲啰啉类、水杨酸类以及联吡啶类螯合剂。

多氨基羧酸类螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺四乙酸(DTTA)和二乙三胺五乙酸(DTPA),主要用于解离-增强镧系荧光免疫分析系统(DELFIA)。此类螯合剂与稀土离子螯合的能力很强，具有稳定性好、在酸性增强液中稀土离子解离快的优点，这样有利于提高分析方法的灵敏度。

β-二酮类螯合剂包括β-NTA、2-噻吩甲酰基三氟丙酮(TTA)和三甲基乙酰三氟丙酮(PTA),它们能与稀土离子形成荧光很强的配合物，但是这些二齿配位体上没有可与抗原(抗体)结合的功能性取代基，并且形成的配合物稳定性较差，不能直接作为标记物进行时间分辨荧光分析。因此，有课题组设计合成一种氯磺酰化的四齿β-二酮，用作稀土离子螯合剂。

此外，4,7-二(氯磺酰基苯基)-1,10-菲啰啉-2,9-二羧酸(BCPDA)是典型的菲啰啉衍生物，主要用于CyberFluoro体系，它的特点是可以与Eu3+配位发出长寿命的荧光，无需加入荧光增强溶液便可直接测定荧光强度，但是BCPDA-Eu3+在时间分辨荧光免疫分析中存在灵敏度较低的缺点，通过引入生物素-链霉亲和素系统(BAS),使得检测灵敏度得到显著提高。

1.2稀土掺杂纳米材料

随着纳米材料和纳米技术在医学、生物传感、环境科学等领域的迅速发展，稀土离子掺杂的纳米颗粒作为一种光致发光纳米材料，以其独特的荧光性能引起了人们的普遍关注。稀土掺杂的纳米晶体在荧光性能优越和荧光寿命长的基础上，具有量子产率高、结构稳定等优点，代替稀土螯合物材料成为新一代荧光纳米探针。

目前，用于制备稀土掺杂纳米颗粒的方法主要包括水(溶剂)热合成法、热分解法、共沉淀法等。绝大部分方法是在亲油性表面活性剂以及其它高沸点的有机溶剂中制备稀土掺杂纳米颗粒的，这将有利于合成尺寸分布范围窄、结晶程度好、核壳结构明确、光学性能优异的高质量纳米颗粒，但该种材料疏水性，不易与生物体系相容。为了使其适用于生物医学领域，需要对纳米粒子进行表面修饰和功能化，增加疏水性稀土掺杂纳米颗粒的亲水性。

研究表明，通过二氧化硅包覆、配体交换、配体氧化、配体吸引、层层自组装以及配体剥离等几种表面修饰方法，如图2所示，可以制备具有良好生物相容性的亲水性纳米材料，从而进一步拓宽TRFIA的应用领域。

1.3其他材料

量子点(quantumdots,QDs)是一种尺寸约为1～10nm的光致发光半导体纳米晶体，具有激发光谱宽且连续分布、发射光谱窄而对称、斯托克斯位移较大、光化学稳定性高、荧光寿命长等优越的荧光特性，是一种理想的荧光探针。Chen等开发了一种基于荧光共振能量转移(FRET)的均相时间分辨荧光免疫分析定量检测癌胚抗原(CEA)的方法，将成功制备的铽螯合物和谷胱甘肽修饰的硒化镉/硫化锌(CdSe/ZnS)量子点分别与不同的抗CEA单克隆抗体(McAb)结合，在双抗体夹心模式下，利用时间分辨荧光检测仪在量子点发射峰(565nm)外检测到与CEA浓度成正比的荧光强度，并与CEA浓度成正比。该方法操作简便、耗时较短、灵敏度高，制备的水溶性量子点的光学性质适合于均相免疫分析，作为一种荧光材料，可以进一步应用于临床检测。

含稀土配合物的荧光聚合物微球结合微球的比表面积大、表面易功能化优点和稀土配合物极宽的斯托克斯位移和超长荧光寿命(约0.5ms)的特性，在时间分辨荧光分析方面也得到了很好的应用。

2TRFIA在免疫分析中的应用

2.1TRFIA在免疫诊断中的应用

免疫诊断是应用免疫学的理论、技术和方法诊断各种疾病以及测定免疫状态，常用技术包括放射免疫、酶联免疫、化学发光等。TRFIA凭借其灵敏度高、特异性强、简便、快速的优点，广泛应用于传染病诊断、肿瘤标志物检测以及其它临床疾病的诊断(表1)。

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